BT-325細(xì)胞系

原代細(xì)胞傳代技術(shù)

一、貼壁細(xì)胞的消化法傳代 
1、吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)，棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。
4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

二、懸浮細(xì)胞的傳代 
1、直接傳代
① 讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，分別接種到另外兩到三個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、離心法傳代
① 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心800-1000rpm，5分鐘。
② 去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細(xì)胞懸液。
③ 將細(xì)胞懸液分別接種到另外兩到三個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

牙髄細(xì)胞的傳代

牙髄細(xì)胞中主要是成纖維細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。

傳代方法：

棄培養(yǎng)液（盡量吸干）

加基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置的0.2%trypsin+0.02%EDTA

輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使消化液浸過(guò)有細(xì)胞的瓶壁

重復(fù)4～5次

迅速吸去消化液

鏡下觀察細(xì)胞變圓回縮（約1分鐘）

加入*培養(yǎng)液（DMEM+10% FCS）終止反應(yīng)

吹打后，1:2接種，繼續(xù)培養(yǎng)。

大鼠系膜細(xì)胞傳代

我用的是DMEM低糖培養(yǎng)液，每次傳代前，將培養(yǎng)液，PBS，0.25％的胰酶（沒加edta）,放37度烤箱預(yù)熱（此做法是減少4度的涼液體對(duì)細(xì)胞的刺激，以防細(xì)胞死亡）。

每次換液時(shí)，一定要燒培養(yǎng)瓶口，做好無(wú)菌觀念。

先拋棄舊液，用PBS先沖凈殘留的血清，再加PBS用滴管輕輕的吹打細(xì)胞，將死細(xì)胞吹打掉。

加胰酶時(shí)注意：若用加edta的，記住了，在鏡下看到細(xì)胞在收縮時(shí)，趕快吸出胰酶，加血清中止消化。血清可抑制胰酶的活性，但對(duì)edta無(wú)效。前后大概不到10秒。若用沒有加edta的，時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)，看到細(xì)胞變?yōu)橛辛Ⅲw感時(shí)，加血清，輕輕拍打，細(xì)胞就會(huì)散開。若團(tuán)塊大，可用滴管吹打。

動(dòng)作一點(diǎn)要快，不能讓細(xì)胞離開培養(yǎng)箱時(shí)間太長(zhǎng)。