抗體芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)是一切生命活動的基礎(chǔ)，受基因表達(dá)的調(diào)控，因而以檢測樣品中的mRNA為基礎(chǔ)的cDNA芯片是當(dāng)今研究中倍受關(guān)注的研究手段。但是，由于存在著轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控以及翻譯后加工等多種調(diào)節(jié)機(jī)制，基因的表達(dá)，或者說mRNA的水平并不必然代表蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。因此，以微陣列技術(shù)對生物樣品作整體蛋白質(zhì)表達(dá)分析的蛋白芯片在后基因組時代越來越受重視?？贵w芯片（Antibody Microarray，抗體微陣列），是蛋白質(zhì)芯片的一種，是檢測生物樣品中蛋白表達(dá)模式的新方法。這種新技術(shù)使得研究人員可以在一次實驗中比較生物樣品中成百上千的蛋白質(zhì)的相對豐度，將極大促進(jìn)蛋白質(zhì)組目前的研究狀況——因為以現(xiàn)有的技術(shù)中對蛋白質(zhì)進(jìn)行這種復(fù)雜的分析是非常困難的。

      Clontech公司*代的抗體芯片Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378種已知蛋白質(zhì)的單克隆抗體，可以在一次簡單實驗中同時檢測樣品中的378種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并且可以在一張芯片上對兩種樣品的表達(dá)模式進(jìn)行比較分析。這使得抗體芯片在毒性實驗、疾病研究和藥物開發(fā)上有廣泛的應(yīng)用前景。Ab Microarray 380芯片上每個抗體都是并列雙點以增加結(jié)果的可靠性，抗體針對廣泛的胞內(nèi)蛋白和膜結(jié)合蛋白，已知參與信號傳導(dǎo)、癌癥、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等廣泛的生物功能，因而可以用于檢測某一特定的生理或病理過程相關(guān)蛋白的表達(dá)模式。盡管抗原來自人，但很多抗體可以識別小鼠或大鼠的樣品。詳細(xì)的資料可以上網(wǎng)查詢。

      芯片上抗體的選擇不但根據(jù)其特異性，也根據(jù)抗體的結(jié)合親和力，在驗證實驗中特異性低、交叉反應(yīng)高、或者信號強(qiáng)度低的抗體都被排除，另外所有抗體都經(jīng)過檢驗保證得到的信號與抗原濃度有良好的線性相關(guān)，那些沒有良好的線性劑量關(guān)系的抗體都被排除。因此抗體芯片能夠檢測到樣品中很低的pg/ml濃度的抗原。

      *代的蛋白芯片和DNA芯片一樣是作為一種定性分析的工具，可用于分析樣品之間相關(guān)蛋白的相對表達(dá)豐度；還可以作為DNA芯片的補充，用于研究蛋白和基因表達(dá)之間的關(guān)系。

操作流程
      抗體芯片并不要求特殊的技能，只要一般常規(guī)的操作就可以完成以往極為復(fù)雜耗時的工作。整個操作流程包括：從50—200mg組織或細(xì)胞、體液中進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提——用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標(biāo)記兩個樣品——洗去多余的標(biāo)記分子——與芯片雜交孵育——掃描分析結(jié)果。整個過程從樣品制備到結(jié)果分析只要一天即可完成，你只要準(zhǔn)備好樣品、熒光染料、脫鹽純化柱（處理體液樣品時用）和熒光掃描儀，其他的試劑全部由試劑盒提供。

優(yōu)化的試劑
      隨芯片試劑盒提供的蛋白抽提/標(biāo)記緩沖液，是專門為抗體芯片而設(shè)計的，非常溫和的去垢劑在能抽提膜結(jié)合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同時能保持蛋白的天然活性（非變性條件），這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性，保證以后的實驗結(jié)果的真實性，和原始材料的一致性。

Internally Normalized Ratio
      根據(jù)操作手冊進(jìn)行內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)化處理可以得到一個內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)化信噪比（INR），內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)化處理是指對兩個樣品（A、B）中分別用兩種熒光標(biāo)記分子（Cy3和Cy5）標(biāo)記，并交叉與芯片雜交（見圖，A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分別和芯片雜交），可以作為消除抗原—抗體結(jié)合效率差異的對照，也可以消除潛在的不同熒光分子的標(biāo)記效率差異。假如Cy5標(biāo)記效率高于Cy3，單純一個實驗的結(jié)果就會有偏差（Cy5標(biāo)記的樣品信號偏高），用這種雙向交叉反應(yīng)就可以消除這種偏差。兩芯片雜交結(jié)果分別得到兩組Ratio值，通過免費下載的工具就可以自動算出每個抗體抗原的INR值，這就代表在兩個樣品間某個蛋白的相對豐度。這種內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)化處理可以大大減小樣品分析的偏差。

      抗體芯片檢測的結(jié)果不是蛋白的含量而是378個目的蛋白在兩個樣品之間的相對豐度。值得注意的是由于抗體抗原結(jié)合的差異、標(biāo)記差異等原因，根據(jù)芯片結(jié)果信號的強(qiáng)弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的多少是不恰當(dāng)?shù)摹?/span>

特點
* 整個分析過程可以在一天內(nèi)完成
* 用熒光分析的方法比較兩個樣品之間378個蛋白質(zhì)的相對豐度
* 適用于包括組織、細(xì)胞系、體液在內(nèi)的多種生物樣品
* 試劑盒提供完整的樣品抽提制備、標(biāo)記、孵育所需的Buffer，特別設(shè)計的樣品制備的過程能保持樣品的完整性和溶解性，保證制備樣品具有代表性和一致性。
* 芯片上的抗體包含針對信號傳導(dǎo)、癌癥、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等廣泛的生物功能的相關(guān)蛋白，跨度大、適用范圍廣。
* 芯片上的抗體分別經(jīng)過特異性抗原、細(xì)胞系和組織的檢測，靈敏度高達(dá)pg/ml
* 開放性的芯片平臺設(shè)計，可以用各種型號DNA芯片熒光掃描儀進(jìn)行檢測。